Administration de streptomycine au côlon de rat à l'aide de nanofibres électrofilées

Scientific Reports volume 12, Numéro d’article: 21503 (2022) Citer cet article

821 accès

1 Altmetric

Détails des métriques

Les nanofibres électrofilées chargées de médicaments sont des systèmes porteurs de médicaments potentiels qui peuvent optimiser le traitement des maladies tout en réduisant l’impact sur les microbes commensales. La faisabilité de nanofibres pullulane chargées de streptomycine fabriquées à partir d’une procédure d’électrofilage vert utilisant de l’eau comme solvant a été évaluée. Nous avons mené une étude chez le rat incluant un groupe traité avec des nanofibres chargées de streptomycine (STR-F, n = 5), un groupe traité avec des concentrations similaires de streptomycine dans l’eau potable (STR-W, n = 5) et un groupe témoin non traité (CTR, n = 5). La streptomycine a été chargée avec succès dans des nanofibres et délivrée par ce véhicule, ce qui a minimisé la quantité de médicament libérée dans le compartiment iléal de l’intestin. E. coli résistant à la streptomycine ingéré a colonisé jusqu’à 106 UFC / g de matières fécales, révélant un effet sélectif de la streptomycine même lorsqu’elle est administrée dans les faibles quantités permises par l’administration à base de nanofibres. Le séquençage par amplicon 16S du microbiote indigène a révélé des effets différentiels dans les trois groupes. Une augmentation des Peptostreptococcaceae dans le caecum des animaux STR-F peut indiquer que la fermentation des nanofibres a directement ou indirectement favorisé la croissance des bactéries au sein de cette famille. Nos résultats élucident les propriétés pertinentes des nanofibres électrofilées en tant que nouveau véhicule pour l’administration d’antimicrobiens au gros intestin.

Les antibiotiques sont essentiels pour contrôler et prévenir les infections, mais peuvent également perturber les bactéries non ciblées dans la lumière intestinale1,2,3. Les effets négatifs des thérapies antimicrobiennes comprennent la perturbation du microbiote intestinal commensale ainsi que le développement de bactéries résistantes aux médicaments3,4.

Les développements dans le domaine des technologies des biomatériaux ont fourni des supports de médicaments avancés, tels que les nanofibres, qui pourraient aider à surmonter les défis liés à l’efficacité des médicaments thérapeutiques, à réduire le risque de développer une résistance aux antimicrobiens5,6 et potentiellement à minimiser l’impact sur le microbiote intestinal.

Il est intéressant de noter que l’administration de médicaments par des porteurs nanostructurés a démontré des caractéristiques pertinentes telles que l’inhibition efficace de la croissance bactérienne et la libération prolongée7. De plus, les systèmes d’administration de médicaments à base de polysaccharides, en particulier le pullulan, attirent davantage l’attention car ils sont non toxiques, stables, biocompatibles et biodégradables8,9,10,11. L’électrofilage, qui est un système simple et rapide de formation de nanofibres, progresse dans la création de nouveaux types de nanostructures, notamment des feuilles multicouches12,13, des nano-hybrides14,15 et des nanofibres noyau-coque14,16. Différentes stratégies potentielles d’électrofilage pour manipuler les comportements de libération de médicaments afin d’améliorer l’effet thérapeutique ont récemment été examinées17,18. Face à l’utilisation généralisée des nanofibres électrofilées pour les applications d’administration de médicaments, plusieurs systèmes à base de nanofibres électrofilées introduits impliquent des solvants organiques dans le processus de fabrication6. Ici, nous avons utilisé un procédé vert, y compris le pullulan comme biopolymère de qualité alimentaire et l’eau comme solvant. Le pullulan est un polysaccharide linéaire produit à partir du champignon Aureobasidium pullulans et se compose d’unités de type maltotriose c’est-à-dire liées α-(1 → 6) avec (1 → 4)-α-d-triglucosides19. Ce schéma de liaison unique conduit à une adhérence et une résistance à la traction élevées du pullulan20. Contrairement à de nombreux autres polysaccharides, le pullulane se dissout facilement dans l’eau en raison du faible degré de liaison hydrogène. Il offre un bon potentiel de traitement pour la formation de films et de fibres et, en raison de sa nature non hygroscopique, présente une résistance mécanique intermoléculaire considérable8,19,21,22. De plus, ce biopolymère est un support approprié pour les applications d’administration de médicaments en raison de ses propriétés non mutagènes, non cancérogènes, biodégradables, mucoadhésives et cytoadhéses6,9,13.

Étant donné que la résistance aux antimicrobiens est l’une des plus grandes menaces mondiales pour la santé publique et que nous sommes actuellement à l’aube d’une ère post-antibiotique23, l’administration d’antimicrobiens spécifiques au site est préférable. Les approches qui augmentent la concentration locale d’antibiotiques uniquement dans les sites où ils sont censés avoir un effet pourraient être un moyen de réduire le développement de la résistance aux médicaments. Par conséquent, cette étude visait à décrire l’impact des nanofibres de pulluan chargées de streptomycine ingérées sur la communauté bactérienne intestinale chez le rat par rapport à l’administration de streptomycine par l’eau potable. De plus, l’effet sélectif sur une souche bactérienne résistante ingérée a été évalué.

Les tests de diffusion disque, effectués par la méthode Kirby-Bauer, ont confirmé que l’activité antimicrobienne de la streptomycine demeurait après le chargement dans des fibres électrofilées. Ainsi, les nanofibres chargées de streptomycine ont inhibé la croissance des souches sensibles d’E. coli et de S. aureus (Fig. 1). Dans l’ensemble, nous concluons que l’encapsulation du médicament n’a pas affecté les propriétés antimicrobiennes du médicament. Ainsi, les nanofibres électrofilées étaient appropriées pour maintenir le niveau thérapeutique optimal du médicament antimicrobien in vitro. Une étude similaire réalisée avec l’amoxicilline a démontré que l’intégration antimicrobienne de nanofibres ne compromet pas la libération et l’activité du médicament24. Par conséquent, les nanofibres électrofilées peuvent être pertinentes dans diverses applications dans le domaine de l’administration de médicaments.

Essai de diffusion sur disque. a) Résultats de la diffusion sur disque de S. aureus du pullulan chargé de streptomycine et b) Résultats de la diffusion sur disque d’E. coli du pullulan chargé de streptomycine.

Une étude chez le rat a été réalisée pour étudier les effets des nanofibres transportant la streptomycine sur le degré de colonisation d’E. coli MG1655-K12 résistant à la streptomycine. Avant l’inoculation, aucune résistance de fond à la streptomycine ou à la gentamycine n’a été détectée dans les échantillons fécaux de ces animaux (données non présentées). Le jour 1 et le jour 2 après l’inoculation, beaucoup plus d’E. coli résistant à la streptomycine ont été trouvés dans les échantillons fécaux de rats ayant reçu de la streptomycine encapsulée dans les nanofibres (STR-F) ou dans l’eau potable (STR-W) que dans le groupe témoin (CTR) (Fig. 2a). Aucune différence n’a été observée entre STR-F et STR-W (Fig. 2a). Des nombres plus élevés d’E. coli résistants ont été trouvés dans les échantillons cécaux des animaux STR-W, tandis que la différence entre le groupe STR-F et le CTR n’était pas significative (Fig. 2b,c). Aucune différence dans le nombre d’E. coli résistants entre les groupes n’a été observée dans les échantillons de côlons et de selles prélevés le jour 3, probablement parce que le traitement à la streptomycine a cessé le jour 2 dans les STR-W et les STR-F.

L’UFC compte. a) le nombre d’UFC à E. coli par gramme de matières fécales aux jours 1, 2 et 3; b) le nombre d’UFC d’E. coli par gramme de teneur en caecum aux jours 1, 2 et 3; (c) Le nombre d’UFC d’E. coli par gramme de contenu du côlon au jour 1, au jour 2 et au jour 3. *(P < 0,05); **(P < 0,01); (P < 0,001). Seulement quatre échantillons ont été prélevés à partir du CTR le jour 1.

La streptomycine, administrée sous forme de 5 g/L dans l’eau potable, est utilisée depuis des décennies dans des modèles animaux pour supprimer les bactéries anaérobies facultatives et permettre ainsi aux espèces de protéobactéries résistantes à la streptomycine ingérées de surmonter la barrière de colonisation25,26,27. Dans la présente expérience, nous avons appliqué une concentration beaucoup plus faible (0,25 g / L) dans l’eau potable des rats STR-W dans le but de correspondre à la quantité absolue de 7 mg de streptomycine donnée sous forme de nanofibres aux rats STR-F. Néanmoins, nos résultats démontrent qu’il est possible d’obtenir la prolifération intestinale de bactéries résistantes à cette concentration 20 fois inférieure à la norme actuellement appliquée.

La mesure de la consommation réelle d’eau au cours de l’expérience a révélé que la streptomycine totale consommée par les rats STR-W était d’environ 12,5 mg, compte tenu d’un déversement estimé à 50%. Comme mentionné ci-dessus, la streptomycine administrée par nanofibres aux rats STR-F au cours de l’expérience était d’environ 7 mg.

La concentration de streptomycine libérée dans l’intestin à partir de nanofibres a été évaluée par ELISA du contenu intestinal de rat obtenu le jour 3. Fait intéressant, nous avons observé une concentration significativement plus faible (P < 0,005) de streptomycine dans les échantillons iléaux du groupe STR-F, par rapport au groupe STR-W (Fig. 3). Nous supposons que les capsules de gélatine enrobées commencent à se dissoudre dans l’intestin grêle et libèrent les fibres pullulane électrofilées, qui ont des propriétés mucoadhésives9. Les nanofibres pullulane se dissolvent ensuite et forment une construction mucoadhésive semblable à de la gelée, retenant partiellement le médicament à travers l’iléon et se déplaçant dans le gros intestin, où plus de médicament est progressivement libéré.

Concentrations de streptomycine. La carte thermique reflétant les niveaux approximatifs de streptomycine présents dans les niveaux de STR-W et de STR-F de l’iléon, du caecum et du côlon est différente dans les échantillons iléaux (P < 0,005), tandis que les niveaux dans le caecum et le côlon ne diffèrent pas entre les deux groupes. Le test était saturé au-dessus de 50 ng / mL. La figure a été réalisée dans GraphPas Prism comme décrit dans la section méthodes.

Conformément à nos observations, les fibres noyau-coque, qui sont produites par électrofilage coaxial, ont déjà montré une libération soutenue réussie de médicaments hydrophiles tels que la streptomycine28. En ce qui concerne les applications d’administration de médicaments utilisant des nanofibres de pullulane, plusieurs études se concentrent sur les propriétés de dissolution rapide du pullulane et le recommandent pour les approches d’administration rapide par voie buccale8,19,29,30 ou pour les applications de pansement6,31. Nos résultats suggèrent que les nanofibres pullulane chargées d’antibiotiques conviennent également à la livraison dans le gros intestin, en raison des propriétés mucoadhésives du pullulan dissous.

Le séquençage des amplicons du gène de l’ARNr 16S a été réalisé pour évaluer l’effet du traitement par streptomycine sur le microbiote intestinal. La richesse microbienne a été significativement réduite dans les échantillons fécaux des groupes STR-F (P = 0,008) et STR-W (P = 0,007), par rapport au groupe CTR (Fig. 4). Dans le caecum, une richesse légèrement plus élevée a été observée dans le groupe CTR que dans les échantillons STR-F.

Richesse microbienne dans le caecum, le côlon et les matières fécales. Les échantillons sont indiqués par des points, tandis que les barres horisontales marquent les moyennes. Les valeurs de p provenaient du test de permutation de la moyenne et étaient indiquées comme suit: *(P < 0,05); **(P < 0,01); (P < 0,001).

La diversité bêta a été comparée entre les groupes en fonction de la dissimilitude de Bray-Curtis et visualisée avec une mise à l’échelle multidimensionnelle non métrique (NMDS). Trois groupes distincts représentaient respectivement des échantillons STR-W, STR-F et CTR (Fig. 5a). Dans l’ensemble, le traitement était plus influent que l’emplacement dans l’intestin, basé sur le modèle PERMANOVA (0,27 [R2 pour le groupe] vs 0,09 [R2 pour la localisation], P = 0, test de permutation avec 100 itérations). La comparaison par paires de tous les groupes à chaque endroit était significative dans tous les cas, à l’exception des échantillons fécaux des deux groupes traités par STR (Fig. 5b).

Compositions microbiennes dans le caecum, le côlon et les fèces. a) Les compositions microbiennes globales des échantillons au niveau de l’ASV ont été évaluées avec une distance de Bray-Curtis et visualisées avec une mise à l’échelle multidimensionnelle non métrique (NMDS). (b) Un tableau montrant la comparaison de la diversité bêta entre les groupes à un endroit donné et les valeurs P sont dérivés des modèles PERMANOVA utilisant la distance de Bray-Curtis. (c) Graphiques à barres montrant la composition taxonomique des 10 phylums les plus abondants.

Ensemble, Bacteroidetes et Firmicutes constituaient plus de 99% des ASV identifiés dans les échantillons de rats. Nous avons constaté une réduction significative de l’abondance relative de Firmicutes et une augmentation relative correspondante des Bacteroidetes dans les groupes STR-W et STR-F dans des échantillons de caecum, de côlon et de fèces (Fig. 5c).

Au niveau familial, des niveaux plus faibles de Lactobacillaceae ont été trouvés dans le caecum des animaux STR-F par rapport à STR-W et CTR (Fig. 6), tandis qu’une plus grande abondance de Peptostreptococcaceae, en particulier Romboutsia, a été observée (Fig. 6). Les Peptostreptococcaceae sont des commensaux chez les rats sains32, et Romboutsia, qui appartient à la famille des Peptostreptococcaceae, est constitué de microorganismes anaérobies adaptés pour utiliser une large gamme de glucides et repose sur des acides aminés et des peptides exogènes pour la synthèse des protéines33. Nous supposons que les niveaux plus élevés observés de cette espèce dans le groupe STR-F que dans le groupe STR-W résultent de la fermentation de nanofibres dans le côlon, ce qui favorise directement ou indirectement la croissance des bactéries au sein de cette famille. Les parties non digestibles des nanofibres étaient composées d’unités maltotrioses reliées par des liaisons α-1,6, qui sont résistantes aux enzymes intestinales des mammifères mais sont disponibles pour la fermentation bactérienne dans le gros intestin34.

Graphique arborescent montrant la comparaison des abondances relatives des taxons entre les groupes. Le plus grand nœud au centre est la bactérie du royaume. Le long de la branche de l’arbre vers l’extérieur, le nœud suivant est le niveau du phylum, suivi de la classe, de l’ordre, de la famille et du genre. La taille du nœud est proportionnelle à l’abondance relative moyenne au niveau phylogénétique correspondant. Un nœud est étiqueté et coloré lorsqu’il a des abondances relatives significativement différentes (test de permutation) entre les groupes. La figure a été faite en R comme décrit dans la section « Méthodes ».

La streptomycine peut être incorporée dans des nanofibres électrofilées sans perdre l’activité antibactérienne, et en outre, elle peut être retenue avec succès par l’intestin grêle et administrée au gros intestin des rats par dosage avec des nanofibres encapsulées. Nos résultats suggèrent que les nanofibres électrofilées représentent une alternative avancée pour l’administration d’antimicrobiens au gros intestin. Cette approche est susceptible de permettre de réduire la quantité d’antibiotiques nécessaire pour être efficace, et donc de réduire le risque de développement de résistances, et de causer moins de perturbations du microbiote indigène. En effet, on a constaté que l’administration par les nanofibres affectait le microbiote d’une manière différente de celle par l’eau potable.

Pullulan a été aimablement fourni par HAYASHIBARA CO., LTD (Japon). L’eau a été purifiée à l’aide d’un système de purification d’eau Milli-QPlus 185 (Millipore, Bedford, MA) avec une résistivité supérieure à 18 MΩ·cm. Des disques étalons de streptomycine (25 μg par disque) ont été achetés à Oxoid, au Danemark. L’hexaméthyldisilazane (HMDS) a été obtenu auprès de Merck (Allemagne). La streptomycine, la gentamycine, le tréhalose et le RSM (lait écrémé en poudre) ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich, au Danemark.

La streptomycine a été chargée dans des nanofibres électrofilées pullulane avec des concentrations finales de 1 et 10% respectivement (p / p; poids de la streptomycine par rapport au poids du polymère). Pour l’encapsulation de la streptomycine dans Pullulan, la poudre de streptomycine a d’abord été dissoute dans l’eau, puis la poudre de pullulane a été ajoutée à la solution pour atteindre la concentration souhaitée. Pour obtenir 1 % ou 10 % de streptomycine en constructions pullulanes (p/p), on a d’abord obtenu une solution de streptomycine à 0,2 % ou 2 % (p/v) dans l’eau sous léger agité à 25 °C pendant 4 h. Ensuite, la poudre de pullulan a été ajoutée pour faire une solution à 20% (p / v) de pullulan dans l’eau et a été agitée pendant une nuit à température ambiante. Par exemple, pour la fabrication d’une feuille de nanofibres de streptomycine à 1 % (p/p) : pullulane, la streptomycine a été dissoute dans de l’eau (conc. 2 mg/mL) sous léger agité à 25 °C pendant 4 h. Ensuite, de la poudre de pullulan (0,2 g) a été ajoutée à la solution de 1 mL pour obtenir la concentration finale souhaitée de 20% de pullulane dans l’eau pour une électrofilature optimale. Enfin, la solution a été filtrée stérile à travers un filtre de 25 mm (Sigma Aldrich) et utilisée pour l’électrofilage.

Pour l’électrofilage, un système d’électrofilage conventionnel personnalisé comprenant une source haute tension (Glassman, FJ50P2.4-F22), une pompe à seringue (Aladdin, AL-1000) connectée à une seringue avec une aiguille hypodermique de 21 G et un collecteur statique a été utilisé. Les paramètres de rotation optimisés ont été réglés sur un débit d’alimentation de 1 mL/h, une tension de 14 à 16 kV, une distance de 15 cm entre la pointe de l’aiguille et le collecteur, une humidité de 35 % et une température de 25 °C. La chambre d’électrofilage comprenant la pompe et le collecteur a été désinfectée par EtOH 70% avant de commencer chaque procédure d’électrofilage.

Pour déterminer si l’efficacité de l’activité antimicrobienne de la streptomycine persiste après l’électrofilage, nous avons effectué un test de diffusion discale par la méthode Kirby-Bauer35. L’activité antibactérienne de la streptomycine chargée dans des feuilles de nanofibres a été analysée contre les bactéries à Gram négatif (Escherichia coli (E. coli) MG1655 subst. K12 (ATCC 47076)) et à Gram positif (Staphylococcus aureus (S. aureus) (ATCC 2928)) sensibles à la streptomycine. Les souches d’E. coli et de S. aureus ont été cultivées pendant la nuit dans des plaques de Luria Bertani (LB) à 37 °C. Un inoculum pour chaque échantillon a été préparé et la turbidité de la suspension a été ajustée dans un densitomètre (Sensititre-Nephelometer, Thermo Fisher, Danemark) par rapport à la norme McFarland de 0,5. Ensuite, une centaine de microlitres de l’inoculum ont été étalés sur des plaques de gélose Mueller-Hinton. Les feuilles électrofilées contenant 10 μg et 100 μg (à partir de 1 et 10% p/p de streptomycine:nanofibres pullulan) ont été coupées avec un poinçon de biopsie de 6 mm, puis placées à côté des disques standard de streptomycine du même diamètre (25 μg) (Oxoid, Danemark) comme témoin. Des feuilles électrofilées non chargées de streptomycine (nanofibres de pullulane) ont été incluses comme témoins négatifs. Les échantillons ont été incubés à 35 °C pendant 16–18 h. Le diamètre de la zone d’inhibition a été mesuré et comparé aux valeurs de point de rupture fournies par les directives EUCAST (https://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Breakpoint_tables/v_11.0_Breakpoint_Tables.pdf).

Pour doser des rats avec des nanofibres chargées d’antibiotiques, les feuilles électrofilées de streptomycine:pullulan à 10% ont été coupées manuellement pour former des particules carrées d’environ 1 mm de longueur. Ensuite, des capsules de gélatine à coque dure (Torpac taille 9) ont été enrobées dans une solution à 12% (p/v) d’Eudragit L100 dans de l’IPA où du sébacate de dibutyle a été ajouté comme plastifiant dans un rapport de 5% p/p par rapport à Eudragit. Enfin, les capsules ont été remplies de 12 mg de particules (équivalent à 1,2 mg de streptomycine par capsule) avant d’être administrées aux rats.

Pour savoir si la feuille électrofilée en nanofibre chargée de streptomycine affectait l’établissement de bactéries résistantes à la streptomycine dans l’intestin, nous avons effectué une étude chez le rat impliquant l’inoculation orale des animaux avec l’E. coli MG1655 sous la K12, identifiant de taxon 511145 (https://www.uniprot.org/uniprot/A0A4D6FVK6) résistant à la streptomycine administré sous forme de nanofibres encapsulées, dans l’eau potable ou sans streptomycine sous forme de streptomycine contrôle (Fig. 7). La souche marquée par fluorescence a été choisie pour permettre une vérification facile par microscopie.

Plan de l’étude. Représentation schématique de l’étude in vivo, représentant CTR (témoin), qui a reçu une capsule de gélatine à coque dure placebo, STR-F (nanofibres chargées en streptomycine), qui a reçu une capsule enrobée d’Eudragit 100S et chargée de particules de pullulane chargées d’antibiotiques deux fois par jour, et STR-W (streptomycine dans l’eau potable) a reçu une capsule de gélatine à coque dure placebo et de la streptomycine dans l’eau potable (0,25 g / L). Tous les groupes ont reçu une dose unique de 108 UFC d’Escherichia coli résistant à la streptomycine. La figure a été créée dans BioRender par les auteurs.

Quinze rats Sprague-Dawley mâles âgés de 8 semaines (Charles River) ont été répartis en trois groupes de cinq et logés individuellement dans des scantainers (Scanbur). Après une période d’acclimatation de sept jours, les animaux ont été traités avec de la streptomycine soit dans de l’eau potable (STR-W), à l’intérieur de particules de nanofibres électrofilées (STR-F), soit n’ont reçu aucun médicament antimicrobien (CTR). Les rats CTR ont reçu une capsule de gélatine à coque dure placebo, les rats STR-F ont reçu une capsule de gélatine à coque dure remplie de particules de pullulane chargées d’antibiotiques, comme décrit ci-dessus, deux fois par jour pendant 3 jours (jours 0, 1 et 2), tandis que les rats STR-W ont reçu une capsule de gélatine à coque dure vide de placebo et de la streptomycine dans l’eau potable (0,25 g/L) pendant les trois mêmes jours (Fig. 7). Nous avons visé une concentration dans l’eau potable, ce qui ferait que la consommation totale de streptomycine par les rats STR-W correspondrait aux quelque 7 mg administrés aux rats STR-F, étant donné que la consommation moyenne d’eau se situait entre environ 30 et 50 ml d’eau / animal / jour. Pour cette étude, les E. coli résistants à la streptomycine et à la gentamycine ont été incubés sur gélose LB (SSI Diagnostica A/S) pendant 16 heures, comme décrit précédemment. Une colonie a été transférée dans un bouillon LB complété par 20 μg/mL de gentamycine et 100 μg/mL de streptomycine pendant la nuit/16 h à 37 °C pendant le brassage. La culture a été centrifugée à 5000×g pendant 10 min, lavée et remise en suspension dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile jusqu’à une densité cellulaire de 109 UFC/mL. Vingt-quatre heures après le début du traitement par la streptomycine, tous les groupes ont reçu une dose unique d’environ 108 UFC de la souche. Les animaux ont été nourris et ont reçu de l’eau ad libitum tout au long de l’expérience.

Des échantillons fécaux (environ 1 g) ont été prélevés avant l’inoculation et 24 h, 48 h et 72 h après l’inoculation. Après 72 h, les animaux ont été euthanasiés par asphyxie au CO2 suivie d’une décapitation. Des rats ont été disséqués et le contenu luminal a été recueilli de manière aseptique dans les régions distale de l’iléon, du caecum et du côlon. Le contenu de ces sections a été pesé et homogénéisé. Des dilutions décuplées ont été étalées sur des plaques de gélose LB supplémentées en streptomycine (100 μg/mL) ou en gentamycine (25 μg/mL) (Sigma-Aldrich, Danemark), selon le cas. Les numérations de l’UFC ont été évaluées après une incubation de 24 à 72 heures à 37 °C dans des conditions anaérobies. Des colonies aléatoires ont été analysées par spectrométrie de masse à l’aide de Bruker Reflex™ III MALDI-TOF (Bruker‐Daltonik, Allemagne) pour s’assurer que les isolats correspondaient à E. coli K-12 MG1655.

Pour estimer la quantité de médicament libérée dans la lumière intestinale, un test ELISA a été effectué pour vérifier la concentration de streptomycine présente dans les matières fécales. Les boulettes fécales de l’iléon, du caecum et du côlon ont été analysées. Les échantillons ont été homogénéisés et dilués, et la procédure a été effectuée conformément aux instructions du fabricant SM Streptomycin ELISA (Elabscience, USA) (Catalogue # E-FS-E031). La densité optique (OD) a été mesurée à l’aide d’un lecteur de microplaques Biotek EL800 (Agilent, DK), réglé à 450 nm et 630 nm. Les données ont été traitées à l’aide du logiciel GraphPad Prism 8.1.1.

L’extraction de l’ADN, la préparation de la bibliothèque et le séquençage ultérieur sur la plateforme Ion Torrent ont été effectués comme décrit précédemment36. Brièvement, les échantillons étaient constitués d’échantillons fécaux à 72 h (n = 15), d’échantillons d’iléon (n = 15) et d’échantillons de côlon (n = 15). L’ADN microbien a été extrait en utilisant ~ 0,2 g de matériaux avec le kit d’isolation DNeasy® PowerLyzer® PowerSoil® de Qiagen. L’ADN extrait a été conservé à − 20 °C avant utilisation.

L’amplification de la région V3 du gène de l’ARNr 16S a été réalisée comme suit : le mélange-maître de PCR comprenait 0,2 μL d’ADN polymérase haute fidélité Phusion (ThermoFisher Scientific F-553L), 4 μL de tampon HF, 0,4 μL de dNTP (10 mM de chaque base), 1 μM d’amorce directe (PBU; 5ʹA-adapter-TCAG-barcode-CCTACGGGAGGCAGCAG-3ʹ) et 1 μM d’amorce inverse (PBR; 5ʹ-trP1-adapter-ATTACCGCGGCTGCTGG-3ʹ) et 5 ng d’ADN fécal communautaire dans un volume de réaction total de 20 μL. Les deux amorces (TAG Copenhagen A/S) ont été liées à des adaptateurs de séquençage et l’amorce avant contenait en outre un code-barres unique de 10 pb (adaptateurs de codes-barres Ion Xpress™) pour chaque échantillon. Le programme de PCR a consisté en une dénaturation initiale pendant 30 s à 98 °C, suivie de 24 cycles de 98 °C pendant 15 s et 72 °C pendant 30 s, et enfin, de 72 °C pendant 5 min pour permettre une extension finale avant refroidissement à 4 °C. Aucun témoin sans gabarit a été inclus pour chaque cycle de PCR, ce qui a donné lieu à une concentration inférieure à 0,05 ng/μL. Les produits PCR ont été purifiés à l’aide de billes magnétiques HighPrepTM PCR (MAGBIO, AC-60005) avec un support magnétique à 96 puits (MAGBIO®,® MyMag 96), conformément aux recommandations du fabricant. La quantité d’ADN a été mesurée à l’aide du test Qubit® dsDNA HS (InvitrogenTM, Q32851) et séquencée sur puce à l’aide des systèmes Ion OneTouchTM et Ion PGM avec une puce 318-Chip v2 incorporant la chimie Hi-Q en séries de 200 pb.

Les séquences brutes ont été démultiplexées avec des codes-barres et des amorces supprimés à l’aide de QIIME237. Les séquences obtenues ont ensuite été filtrées pour aller de 125 à 180 pb. Ces lectures prétraitées ont été analysées avec le pipeline DADA2 dans R38, en utilisant les paramètres recommandés pour Ion Torrent. Les variantes de séquence d’amplicon (ASV) obtenues ont ensuite été annotées taxonomiquement à l’aide de la base de données du Ribosomal Database Project (RDP) (version 11.5).

L’analyse statistique a été effectuée avec QIIME2, R et GraphPad Prism Software 8.1.1. Les échantillons ont été raréfiés à une profondeur égale de lectures avant de calculer la richesse. Le nombre d’UFC, la concentration de streptomycine, la richesse microbienne et l’abondance des taxons ont été comparés à un test de permutation bilatéral. Les ASV (variante de séquençage Amplicon) avec moins de 0,01% d’abondance relative ont été retirés avant une analyse plus approfondie. La diversité bêta a été évaluée sur la base de la matrice de distance de Bray-Curtis et comparée à l’analyse multivariée permutationnelle de la variance (PERMANOVA). La composition taxonomique montrée avec des arbres a été générée avec le « métacodeur » R-package39. Le seuil de signification a été fixé à 0,5. La comparaison des taux de streptomycine évalués par ELISA chez les animaux STR-F et STR-W a été effectuée par test t en supposant des variances égales.

L’inspection danoise des expériences sur les animaux a approuvé l’essai sur les animaux sous le numéro de licence 2020-15-0201-00484. Le protocole d’expérience a été pré-enregistré par BioFacility de DTU. Les animaux ont été surveillés quotidiennement pendant l’expérience, et l’expérience a été réalisée conformément aux directives nationales danoises et supervisée par le Comité du bien-être animal de l’Institut pour le soin et l’utilisation des animaux. Les méthodes sont rapportées conformément aux lignes directrices ARRIVE.

Les données de séquence ont été déposées dans NCBI Sequence Read Archive sous le numéro PRJNA758361.

Nitzan, O., Elias, M., Peretz, A. & Saliba, W. Rôle des antibiotiques dans le traitement des maladies inflammatoires de l’intestin. Journal mondial de gastroentérologie. 22, 1078–1087 (2016).

Article CAS Google Scholar

Francino, M. P. Les antibiotiques et le microbiome intestinal humain: dysbioses et accumulation de résistances. Devant. Microbiol. 6, 1–11 (2016).

Article Google Scholar

Shah, T., Baloch, Z., Shah, Z., Cui, X. & Xia, X. Le microbiote intestinal : impacts de l’antibiothérapie, résistance à la colonisation et maladies. Int. J. Mol. Sci. 22, 6597 (2021).

Article CAS Google Scholar

Fair, R. J. & Tor, Y. Antibiotiques et résistance bactérienne au 21ème siècle. Perspect. Méd. Chem. 6, 25-64. https://doi.org/10.4137/PMC.S14459.Received (2014).

Article Google Scholar

Patra, J. K. et coll. Systèmes d’administration de médicaments nanométriques: développements récents et perspectives d’avenir 10 Technologie 1007 Nanotechnologie 03 Sciences chimiques 0306 Chimie physique (y compris structurelle) 03 Sciences chimiques 0303 Chimie macromoléculaire et des matériaux 11 Médical et He. J. Nanobiotechnologie. 16, 1–33 (2018).

Google Scholar

Ajalloueian, F. et al. Les nanofibres multicouches à base de pulllan chargées d’amoxicilline conservent des propriétés antibactériennes à long terme avec un profil de libération accordable pour les applications topiques d’administration cutanée. Int. J. Biol. Macromol. 215, 413–423 (2022).

Article CAS Google Scholar

Mamun, M. M., Sorinolu, A. J., Munir, M. & Vejerano, E. P. Nanoantibiotiques: Fonctions et propriétés à l’échelle nanométrique pour lutter contre la résistance aux antibiotiques. Devant. Chem. 9, 1-23 (2021).

Article Google Scholar

Hsiung, E. et al. Nanofibres antibactériennes de complexes d’inclusion pullulan/tétracycline-cyclodextrine pour l’administration de médicaments oraux à désintégration rapide. J. Colloid Interface Sci. 610, 321-333 (2022).

Article ADS CAS Google Scholar

Bulman, S. E. et al. Pullulan: A new cytoadhesive for cell-mediated cartilage repair. Cellules souches Rés. 6, 34 (2015).

Article Google Scholar

Hong, L. et al. Les nanoparticules pulluliennes en tant que prébiotiques améliorent les propriétés antibactériennes de Lactobacillus plantarum grâce à l’induction d’un stress léger dans les probiotiques. Devant. Microbiol. 10, 1–12 (2019).

Article Google Scholar

Mir, M., Ahmed, N. et UrRehman, A. Applications récentes des nanostructures basées sur PLGA dans l’administration de médicaments. Colloïdes Surf. B Biointerfaces 159, 217-231 (2017).

Article CAS Google Scholar

Jeckson, T. A., Neo, Y. P., Sisinthy, S. P. & Gorain, B. Delivery of therapeutics from layer-by-layer electrofilé nanofiber matrix for wound healing: An update. J. Pharm. Sci. 110, 635-653 (2021).

Article CAS Google Scholar

Ajalloueian, F. et al. Nanofibres électrofilées multicouches PLGA-pullulan-PLGA pour l’administration de probiotiques. Hydrocoll alimentaire. 123, 107112 (2022).

Article CAS Google Scholar

Liu, X. et al. Nanohybrides à noyau électrofilé (HPMC-acétaminophène)-Shell (PVP-sucralose) pour une administration rapide des médicaments. Gels 8, 357 (2022).

Article CAS Google Scholar

Liu, H. et al. Films hybrides préparés à partir d’une combinaison d’électrofilage et de moulage pour offrir une libération de médicament à deux phases. Polymère 14, 2132 (2022).

Article CAS Google Scholar

Zhao, K. et al. Membranes nanofibreuses fonctionnelles triaxiales électrofilées et électrofilées modifiées pour la photodégradation naturelle des antibiotiques. Chem. Eng. J. 425, 131455 (2021).

Article CAS Google Scholar

Ji, Y., Song, W., Xu, L., Yu, D. G. & Bligh, S. W. A. Une revue sur les nanofibres de poly(acides aminés) électrofilés et leurs applications de l’hémostase et de la cicatrisation des plaies. Biomolécules 12, 794 (2022).

Article CAS Google Scholar

Fahimirad, S. & Ajalloueian, F. Pansements électrofilés d’origine naturelle pour l’administration ciblée d’agents bioactifs. J. Pharm. 566, 307-328 (2019).

Article CAS Google Scholar

Ponrasu, T., Chen, B.-H., Chou, T.-H., Wu, J.-J. & Cheng, Y.-S. Nanofibres électrofilées à dissolution rapide fabriquées à partir de polysaccharide / pullulane de figue en gelée pour les applications d’administration de médicaments. Polymères (Bâle) 13, 1–17 (2021).

Article Google Scholar

Bailore, N. N., Balladka, S. K., Doddapaneni, S. J. D. S. & Mudiyaru, M. S. Fabrication de films biopolymères compatibles avec l’environnement de collagène pullulan/piscéen/ZnO nanocomposite et leur activité antifongique. J. Polym. Environ. 29, 1192–1201 (2021).

Article CAS Google Scholar

Singh, R. S., Saini, G. K. & Kennedy, J. F. Pullulan: Sources microbiennes, production et applications. Carbohydre. Polyme. 73, 515–531 (2008).

Article CAS Google Scholar

Celebioglu, H. U. et coll. Changements d’adhésion et de sous-protéome stimulés par la mucine et les glucides de la bactérie probiotique Lactobacillus acidophilus NCFM. J. Proteom. 163, 102–110 (2017).

Article CAS Google Scholar

Irwin, R. Imaginer l’avenir postantibiotique: la culture visuelle d’une menace pour la santé mondiale. 48, 1-10. https://doi.org/10.1136/medhum-2020-011884 (2020).

Article Google Scholar

Wang, S. et al. Encapsulation de l’amoxicilline dans des nanofibres de poly(acide lactique-co-glycolique) dopées à la laponite: préparation, caractérisation et activité antibactérienne. ACS Appl. Mater. Interfaces 4, 6393. https://doi.org/10.1021/am302130b (2012).

Article CAS Google Scholar

Lasaro, M. et al. Isolat d’Escherichia coli pour l’étude de la colonisation de l’intestin de souris et son application aux knockouts de signalisation à deux composants. J. Bactériol. https://doi.org/10.1128/JB.01296-13 (2014).

Article Google Scholar

Poulsen, L. K., Licht, T. R., Rang, C., Krogfelt, K. A. & Molin, S. Physiological state of Escherichia coli BJ4 growing in the large intestins of streptomycin-treated mice. J. Bacteriol. 177, 5840-5845 (1995).

Article CAS Google Scholar

Nevola, J. J., Stocker, B. A. D., Laux, D. C. & Cohen, P. S. Colonization of the mouse intestinal by an avirulent Salmonella typhimurium strain and its lipopolysaccharide defective mutants. Infecter. Immun. 50, 152-159 (1985).

Article CAS Google Scholar

Sohrabi, A., Shaibani, P. M., Etayash, H., Kaur, K. & Thundat, T. Libération prolongée de médicaments et activité antibactérienne des fibres poly(méthacrylate de méthyle) et nylon6 noyau / coquille incorporées à l’ampicilline. Polymer (Guildf.) 54, 2699–2705 (2013).

Article CAS Google Scholar

Vila, M. M. D. C., Tardelli, E. R., Chaud, M. V., Tubino, M. & Balcão, V. M. Développement d’un film mucoadhésif buccal pour dissolution rapide: justification mathématique, production et caractérisation physicochimique. Drogue Deliv. 21, 530–539 (2014).

Article CAS Google Scholar

Qin, Z. Y., Jia, X. W., Liu, Q., Kong, B. H. & Wang, H. Fast dissolvant des films oraux pour l’administration de médicaments préparés à partir de nanofibres d’électrofilage de chitosane / pullulane. Int. J. Biol. Macromol. 137, 224–231 (2019).

Article CAS Google Scholar

Román, J. T. et al. Nanofibres pullulane contenant le peptide palindromique antimicrobien LfcinB (21–25)Pal obtenu: Par électrofilage. 9, 20432–20438 (2019).

Article ADS Google Scholar

Leng, Y. et coll. Effets de l’hypertension intra-abdominale aiguë sur les multiples fonctions de barrière intestinale chez le rat. Nat. Publ. Gr. https://doi.org/10.1038/srep22814 (2016).

Article Google Scholar

Gerritsen, J. et coll. L’analyse génomique et fonctionnelle de Romboutsia ilealis CRIB T révèle une adaptation à l’intestin grêle. PeerJ. https://doi.org/10.7717/peerj.3698 (2017).

Article Google Scholar

Spears, J. K., Karr-Lilienthal, L. K. & Fahey, G. C. Influence of supplemental high molecular weight pullulan or γ-cyclodextrin on ileal and total tract nutrient digestibility, fecal characteristics and microbial populations in the dog. Arch. Anim. Nutr. 59, 257–270 (2005).

Article CAS Google Scholar

Hudzicki, J. Kirby-Bauer Disk Diffusion Susceptibility Test Protocol 1–23 (American Society for Microbiology, 2016).

Google Scholar

Laursen, M. F. et coll. Le développement du microbiote intestinal du nourrisson est motivé par la transition vers des aliments familiaux indépendants de l’obésité maternelle. mSphère 1, e00069 (2016).

Article CAS Google Scholar

Bokulich, N. A. et coll. Optimisation de la classification taxonomique des séquences d’amplicon marqueur-gène avec le plugin q2-feature-classifier de QIIME 2. Microbiome 6, 1-17 (2018).

Article Google Scholar

Callahan, B. J. et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nat. Methods 13, 581-583 (2016).

Article CAS Google Scholar

Foster, Z. S. L., Sharpton, T. J. & Grünwald, N. J. Metacoder: An R package for visualization and manipulation of community taxonomic diversity data. Calcul PLoS. Biol. 13, e1005404 (2017).

Article ADS Google Scholar

Télécharger les références

Cette recherche a été financée par la Fondation Novo Nordisk (NNF17OC0026910), MIMIO–Microstructures, microbiote et administration orale, ainsi que par la Fondation nationale danoise pour la recherche (DNRF122) et la Fondation Villum (subvention n ° 9301), Center for Intelligent Drug Delivery and Sensing Using Microcontainers and Nanomechanics (IDUN). Les auteurs remercient les gardiens d’animaux de DTU BioF pour avoir manipulé les animaux.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Priscila R. Guerra et Fatemeh Ajalloueian.

National Food Institute, Université technique du Danemark, 2800, Kgs. Lyngby, Danemark

Priscila R. Guerra, Shaodong Wei, Katja Ann Kristensen, Martin Iain Bahl et Tine Rask Licht

Département des technologies de la santé, Université technique du Danemark, 2800, Kgs. Lyngby, Danemark

Fatemeh Ajalloueian & Anja Boisen

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

P.R.G. et F.A. ont contribué à la conception de l’étude, à la préparation des nanofibres, à l’étude in vivo, à l’analyse des données et à la préparation du manuscrit. K.A.K. a contribué à l’étude in vivo, à ELISA et à la préparation du séquençage. S.W. a contribué à l’analyse des données et à la préparation du manuscrit. M.I.B., A.B. et T.R.L. ont contribué à la conception de l’étude, à l’analyse des données et à la préparation du manuscrit. Tous les auteurs ont examiné et approuvé le manuscrit.

Correspondance avec Tine Rask Licht.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International, qui permet l’utilisation, le partage, l’adaptation, la distribution et la reproduction sur tout support ou format, à condition que vous donniez le crédit approprié au(x) auteur(s) original(s) et à la source, fournissez un lien vers la licence Creative Commons et indiquez si des modifications ont été apportées. Les images ou autres éléments de tiers contenus dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l’article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit du matériel. Si le matériel n’est pas inclus dans la licence Creative Commons de l’article et que votre utilisation prévue n’est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l’utilisation autorisée, vous devrez obtenir la permission directement du détenteur des droits d’auteur. Pour consulter une copie de ce permis, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Réimpressions et autorisations

Guerra, P.R., Ajalloueian, F., Wei, S. et al. Livraison de streptomycine au côlon du rat à l’aide de nanofibres électrofilées. Sci Rep 12, 21503 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-25769-z

Télécharger la citation

Reçu: 18 août 2022

Accepté: 05 décembre 2022

Publication : 13 décembre 2022

DEUX: https://doi.org/10.1038/s41598-022-25769-z

Toute personne avec qui vous partagez le lien suivant pourra lire ce contenu :

Désolé, aucun lien partageable n’est actuellement disponible pour cet article.

Fourni par l’initiative de partage de contenu Springer Nature SharedIt

En soumettant un commentaire, vous acceptez de respecter nos Conditions et les Règles de la communauté. Si vous trouvez quelque chose d’abusif ou qui n’est pas conforme à nos conditions ou directives, veuillez le signaler comme inapproprié.